过表达可影响骨髓间充质干细胞膜片成骨及成血(4)
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【摘要】在骨组织工程中,利用非整合载体递送的生长因子会在增殖细胞中逐渐稀释,丢失其相关功能。慢病毒载体相对于其他基因传递系统具有独特的优势,能够
在骨组织工程中,利用非整合载体递送的生长因子会在增殖细胞中逐渐稀释,丢失其相关功能。慢病毒载体相对于其他基因传递系统具有独特的优势,能够将转基因整合到分裂和非分裂细胞的基因组中长期稳定表达,并有较低免疫原性的优点[19],因此慢病毒载体是用于基因治疗的最有前途的方法之一。作者通过预实验选择慢病毒感染复数为20,分别将miR-378a 基因和空载慢病毒转染至BMMSCs,流式结果显示LV-miR-378a-BMMSCs 组转染率为70.6%,LV-BMMSCs 组转染效率为69.3%,两组结果无明显差异(P> 0.05)。激光共聚焦可观察到转染完成后贴壁生长24 h 时,两组细胞贴壁形态均呈不规则形或短梭形,细胞间触角短小,说明慢病毒转染后对细胞形态的影响无明显差异,但直观可见LV-miR-378a-BMMSCs 组细胞增殖密度较LV-BMMSCs 组明显增多。同时CCK-8 生长曲线结果显示,LV-BMMSCs 组较空白组细胞增殖率稍低(P< 0.05),但生长状态均良好,说明慢病毒转染后对细胞的毒性作用小,可能的原因有:慢病毒转染细胞后可能会发生针对慢病毒衣壳蛋白的初次免疫反应,但受体中不存在慢病毒衍生抗原,不会继续发生免疫反应;另外慢病毒缺乏病毒基因,其转染的细胞不能主动产生病毒蛋白[20]。而LV-miR-378a-BMMSCs 组细胞增殖率在第3-10 天时明显高于LV-BMMSCs 组、空白组(P< 0.05),结合激光共聚焦观察到细胞密度差异,提示过表达miR-378a 可促进BMMSCs 增殖。
骨的形成往往与某些成骨及成血管因子密切相关。RUNX2 对于早期成骨细胞分化至关重要,其在未定型的间充质细胞中弱表达,在成骨细胞中上调,在未成熟的成骨细胞中达到最高水平,在成熟成骨细胞中下调[21]。Ⅰ型胶原蛋白由成骨细胞分泌,表达于成骨细胞的细胞外基质形成和成熟过程,是反映早期成骨的重要指标。成血管标志物血管内皮生长因子是血管生成的主要参与者,有助于血管通透性和内皮细胞募集,血小板生长因子则可促进血管的成熟稳定[22]。实验检测了成骨诱导3,7,14 d 后BMMSCs 膜片的成骨及成血管分化能力,结果显示miR-378a 修饰的膜片在RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白、血管内皮生长因子、血小板生长因子的mRNA表达与RUNX2、血管内皮生长因子蛋白表达中表现出不同程度的增加,这与BO 等[8]的研究结果相符。也有研究表明,miR-378a 过表达可靶向CASP3 和激活PI3K/Akt 途径来减弱高糖抑制的成骨分化,并下调促凋亡相关基因的表达[23]。另外,miR-378a 靶标中富集了MAPK 途的因子[24],径可能通过抑制MAPK 激酶抑制剂Ras 1 来激活MAPK/ERK1/2 途径促进血管生成。miR-378a 还可通过抑制潜在靶标FOXN3 及通过Wnt/β-catenin 途径激活来增强黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和致瘤性[25],说明miR-378a 可激活过Wnt/β-catenin 途径发挥调控作用。因此,实验中RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白作为Wnt/β-catenin途径下游因子随miR-378a 的表达而增加[26],血管内皮生长因子与血小板生长因子在PI3K/Akt 和MAPK/ERK1/2 通路中属为正调节因子[27],也随miR-378a 的表达而增多。
综上,通过慢病毒载体可成功构建过表达miR-378a基因内源性修饰的BMMSCs 膜片,同时可以持续稳定递送miR-378a 来增强BMMSCs 的增殖能力和BMMSCs 膜片的成骨及血管生成能力,可作为骨再生潜在的基因治疗工具,为miRNA 结合细胞膜片在骨组织工程中的应用提供了新的思路。但关于miR-378a 基于BMMSCs 的增殖、成骨及成血管分化的具体靶标和相关机制需进一步深入研究,同时还应结合支架材料进行体内实验进一步验证其可行性,这为临床骨缺损再生治疗寻求新的修复方式提供了广阔的研究前景。
作者贡献:实验设计、实施和成文由第一作者完成,实验评估与校审由通讯作者完成,资料收集及核对数据由全部作者共同完成。
经费支持:该文章接受了“新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2018E02060)及新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJ2020G198)”的资助。所有作者声明,经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突:文章的全部作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题:实验方案经经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术,并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
写作指南:该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0517/768.html
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