过表达可影响骨髓间充质干细胞膜片成骨及成血(2)
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【摘要】1.4.3 慢病毒转染效率检测 转染72 h 后,采用流式细胞术检测LV-miR-378a-BMMSCs 组和LV-BMMSCs 组的转染效率。将转染72 h 后的BMMSCs 胰酶消化,以细胞浓度5×106L-1接
1.4.3 慢病毒转染效率检测 转染72 h 后,采用流式细胞术检测LV-miR-378a-BMMSCs 组和LV-BMMSCs 组的转染效率。将转染72 h 后的BMMSCs 胰酶消化,以细胞浓度5×106L-1接种到共聚焦小皿置培养箱培养,24 h 后拍摄共聚焦观察EGFP 表达效率。
1.4.4 转染后BMMSCs 毒性检测 慢病毒转染72 h 后,将3 组细胞以3 000 个/孔接种在96 孔板,孵育24 h 后按10 μL/孔加入CCK-8,以只添加CCK-8 和培养基作为对照,继续孵育2 h,用酶标仪检测450 nm 下吸光度(A)值,以后每天检测一次,连续记录10 d 来评估慢病毒转染对BMMSCs 的毒性作用。
1.4.5 修饰有miR-378a 的BMMSCs 膜片制备 取3 组细胞,按1×105/孔铺6 孔板,24 h 达90%以上汇合,换用膜片诱导液(含120 mg/L 维生素C、体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素的培养基)培养,隔天换液,连续诱导6 d,分别于成膜诱导第2,6 天于镜下观察各组膜片形态并拍照。
1.4.6 RT-PCR 检测成骨及成血管相关基因mRNA 水平 膜片形成后换用成骨诱导液(原培养基中补充有50 μmg/L 维生素C、100 nmol/L 地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸盐)继续诱导,每隔2 d 更换诱导液,每孔液体量2 mL。成骨诱导第3,7,14 天时,使用Trizol 提取各组总RNA,纯度达1.8-2.0 时,反转录制备cDNA,然后进行RT-PCR,均以20 μL 的反应体系,miR-378a 基因检测反应条件:95 ℃3 min,95 ℃12 s,62 ℃40 s,40 个循环;成骨及成血管相关基因检测反应条件:95 ℃2 min,95℃ 5s,57 ℃30 s,40 个循环。最后计算各组miR-378a、成骨及成血管基因(RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白、血管内皮生长因子、血小板生长因子)的表达量变化。实验重复3 次。RT-PCR 引物序列见表1。
表1|RT-PCR 引物序列Table 1|Primer sequences used for RT-PCR
1.4.7 Western blot 评估RUNX2 及血管内皮生长因子蛋白表达水平 连续成骨诱导第14 天,参照文献[12]及相关试剂盒说明,分别刮取3 组膜片,捣碎后加RIPA 裂解,离心取上清,用BCA 蛋白浓度测定盒测定浓度后定量分析,每个样本按5μg 上样量;10%SDS-PAGE 电泳分离后转至PVDF 膜,用5%的脱脂奶粉封闭2 h,一抗[兔抗鼠Anti-RUNX2 抗体(1 ∶1 000)和兔抗鼠Anti-VEGF 抗体(1 ∶1 000)]孵育过夜,1×TBST 洗去多余一抗后加入二抗(山羊抗兔IgG)孵育1 h,清洗后显色,以GAPDH 作为内参。采用Image lab 软件分析各组蛋白条带灰度比值的变化。
1.5 主要观察指标 ①miR-378a 过表达慢病毒载体及空载慢病毒转染BMMSCs 后的转染效率和细胞毒性;②修饰有miR-378a 的成骨BMMSCs 膜片的镜下形态、相关成骨成血管基因及蛋白表达。
1.6 统计学分析 运用SPSS 25.0 统计学软件进行处理,以上实验数据至少重复3 次,流式转染效率两组间采用直接卡方检验,其他实验数据均以表示,采用单因素方差分析,组间数据用LSD-t检验,P< 0.05 为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 BMMSCs 培养及鉴定结果 生长良好的第3 代骨髓间充质干细胞镜下生长密集,呈梭形或纺锤丝状,见图1;流式细胞术检测表面抗原CD29 阳性表达(98.1%),而CD45 阴性表达(4.4%),见图2。
2.2 慢病毒转染效率检测结果 转染72 h 后使用流式细胞仪检测慢病毒载体转染后EGFP 基因表达效率,LV-miR-378a-BMMSCs 组转染率为70.6%,LV-BMMSCs 组为69.3%,两组间转染效率比较差异无显著性意义(P> 0.05),见图3。
采用激光共聚焦观察各组转染效率,根据镜下EGFP绿色荧光显影即可估算转染率,LV-miR-378a-BMMSCs 组及LV-BMMSCs 组转染72 h 后继续传代培养24 h 时的转染效率无明显差异,见图4。
2.3 CCK-8 检测慢病毒转染后的细胞毒性 根据3 组细胞 450 nm 下测得的A值绘制生长曲线,3 组的生长曲线趋势基本一致,均为“S”形,第一二天的细胞增殖较慢,各组细胞增殖活性比较差异无显著性意义(P> 0.05);第3-6 天时,各组细胞增殖速度加快,第7 天达最高峰,从第8-10天细胞数量进入平台期,在各时间段,LV-miR-378a-BMMSCs组第3-10 天的细胞增殖活性高于LV-BMMSCs 组、空白组(P< 0.05),LV-BMMSCs 组第4-10 天的细胞增殖活性低于空白组(P< 0.05),见图5。
2.4 修饰有miR-378a 的BMMSCs 膜片形态学观察 成膜诱导第2 天,LV-miR-378a-BMMSCs 组、LV-BMMSCs 组镜下均可见膜片中央梭形细胞间有少量基质相连,膜片边缘呈毛边状褶皱,不连续;第6 天时,膜片中央细胞重叠密集,大量细胞基质网状交叉相连,膜片边缘呈连续且增宽的褶皱并向中央卷起,与空白组膜片镜下形态变化无明显差异,这表明慢病毒转染对膜片的形态结构无明显影响,见图6。
图1|第3 代骨髓间充质干细胞密度达80%-90%时的镜下形态(×50)Figure 1|Morphology of passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells density reaching 80%-90% (×50)图注:细胞生长密集,呈梭形或纺锤丝状
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0517/768.html
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