过表达可影响骨髓间充质干细胞膜片成骨及成血(3)
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【摘要】图2|流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞的表面标志物Figure 2|Flow cytometry detection of markers on bone marrow mesenchymal stem cells图注:骨髓间充质干细胞表面标志物
图2|流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞的表面标志物Figure 2|Flow cytometry detection of markers on bone marrow mesenchymal stem cells图注:骨髓间充质干细胞表面标志物CD29 呈强阳性,CD45 呈阴性
图3|流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞慢病毒转染效率Figure 3|Flow cytometry detection of bone marrow mesenchymal stem cell transfection efficiency图注:LV-miR-378a-BMMSCs 组与LV-BMMSCs 组转染效率比较差异无显著性意义(P> 0.05)
2.5 各组膜片中成骨及成血管相关基因mRNA 表达 成骨诱 导3,7,14 d 时,LV-miR-378a-BMMSCs 组miR-378a、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白、血管内皮生长因子、血小板生长因子的mRNA 表达水平高于空白组、LV-BMMSCs 组(P< 0.001),LV-BMMSCs 组与空白组miR-378a、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白、血管内皮生长因子、血小板生长因子的mRNA 表达水平比较差异均无显著性意义(P> 0.05),见图7。说明miR-378a 过表达后BMMSCs 膜片在成骨诱导过程中的成骨分化及血管生成明显增强,而空载慢病毒转染后对BMMSCs 膜片的成骨及成血管分化功能无明显影响。
2.6 各组膜片中RUNX2 及血管内皮生长因子蛋白表达Western blot 检 测 结果 显 示,LV-miR-378a-BMMSCs 组 的RUNX2 及血管内皮生长因子蛋白相对表达量均明显增高于LV-BMMSCs 组(P< 0.001)、空白组(P< 0.01),LV-BMMSCs 组RUNX2 及血管内皮生长因子蛋白相对表达量与空白组比较差异无显著性意义(P> 0.05),见图8,证明过表达miR-378a 基因从蛋白水平增强了成骨BMMSCs 膜片的成骨及成血管性能。
图4|骨髓间充质干细胞的慢病毒转染效率(激光共聚焦显微镜,×100)Figure 4 |Lentiviral transfection efficiency of bone marrow mesenchymal stem cells (laser confocal microscopy,×100)图注:两组转染效率无明显差异
图5|慢病毒转染后骨髓间充质干细胞的生长曲线Figure 5|Growth curves of bone marrow mesenchymal stem cells after lentivirus transfection图注:3 组生长曲线均呈“S”形,第一二天的细胞增殖较慢,第3-6天时细胞增殖速度加快,第7 天达最高峰,从第8-10 天细胞数量进入平台期
图6|各组骨髓间充质干细胞膜片形态学观察(×50)Figure 6|Morphological observation of each group of bone marrow mesenchymal stem cell sheets (×50)图注:成膜诱导第2 天,3 组膜片中央梭形细胞间有少量基质相连,膜片边缘呈毛边状褶皱,不连续;第6天时,膜片中央细胞重叠密集,大量细胞基质网状交叉相连,膜片边缘呈连续且增宽的褶皱并向中央卷起;红色箭头示膜片边缘褶皱处。3 组间无明显差异
图7|各组骨髓间充质干细胞膜片相关基因的表达Figure 7|Expression of related genes of bone marrow mesenchymal stem cell sheets of each group图注:A-E 分别为miR-378a、RUNX2、Ⅰ型胶原蛋白、血管内皮生长因子、血小板生长因子的mRNA 表达水平
图8|各组骨髓间充质干细胞膜片RUNX2、血管内皮生长因子蛋白的表达Figure 8|Expression of RUNX2 and vascular endothelial growth factor protein in each group of bone marrow mesenchymal stem cell sheet图注:A 为各组膜片RUNX2、血管内皮生长因子蛋白表达的免疫印迹条带;B 为各组膜片RUNX2、血管内皮生长因子相对于 GAPDH蛋白表达水平的灰度值
3 讨论 Discussion
血管化的自体骨移植被认为是大尺寸骨缺损修复的金标准,但需要额外的手术来获取,同时存在很高的感染和免疫原性的风险,因此加入生长因子的生物活性骨修复材料一直以来都是再生医学研究的重点[13]。随之细胞膜片技术应运而生,并已有研究发现了将外源性或内源性生长因子负载于干细胞膜片的可行性,同时发挥着调控骨缺损的重建工作。课题组前期已成功培养出BMMSCs 膜片,并结合生长因子验证了其对骨再生的功效[14]。因此,此次实验选用BMMSCs作为细胞膜片的来源细胞[15],经流式细胞术鉴定其抗原表型CD29 阳性率(98.1%)、CD45 阴性率(4.4%),证明了干细胞的特性。同时采取相同的维生素C 连续诱导法培养出了干细胞膜片,镜下观察到转染后细胞和空白细胞成膜诱导2,6 d 时的膜片形态变化表现:中央由少量基质相连的单层长梭形细胞变为均匀重叠的膜片,边缘由细而不连续的毛边变成向中央增宽变厚的褶皱,说明慢病毒转载后对细胞成膜具有促进作用,对细胞膜片的正常形态无明显影响。
在骨组织工程研究中,miRNA 家族的加入为骨再生医学的基因疗法注入了新的“血液”[16]。从1993 年被发现以来,miRNA 已成为包括骨量维持在内的各种生理过程的关键调节剂[17]。有研究指出,某些miRNA 积极参与骨再生的成血管和成骨偶联,可提高其在治疗骨相关疾病和骨再生方面的潜能,这些miRNA 有miR-7b、miR-9、miR-26a、miR-210、miR-378等,但仍需进一步研究来阐明其确切的作用机制[18]。对于骨的重建,成骨和血管生成之间的同步偶联极其重要。因此,实验选用miR-378a 作为研究基因,在体外结合细胞膜片技术进一步探索miR-378a 对干细胞膜片生长的影响,以及成骨成血管耦合能力及相关作用机制,为后期体内回植实验提供前期基础。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0517/768.html
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