电喷雾法制备海藻酸盐明胶脂肪干细胞微球及其(3)
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【摘要】2.4 含ADSCs 微球的形态学特征 光学显微镜下观察到,两种含ADSCs 微球的成球效果基本相似,见图4 A,B,加入ADSCs 依然可以通过电喷雾方法制备形成完整的微
2.4 含ADSCs 微球的形态学特征 光学显微镜下观察到,两种含ADSCs 微球的成球效果基本相似,见图4 A,B,加入ADSCs 依然可以通过电喷雾方法制备形成完整的微球。统计结果显示,无论是海藻酸盐微球、海藻酸盐-5 g/L 明胶微球还是包埋ADSCs 的微球,按照上述电喷雾所设置的参数,所合成的各组微球直径为(358.) μm,组间差异无显著性意义(P> 0.05),见图4C,这说明加入5 g/L 的明胶成分以及ADSCs 在海藻酸盐之中都可以形成直径相似的完整微球。
2.5 含细胞微球内细胞增殖情况 如图5 所示,随着培养时间的延长,两种微球所包裹的ADSCs 细胞数量都明显具有增加的趋势,然而海藻酸盐-ADSCs 微球培养第7,14天的细胞数量明显少于海藻酸盐-5 g/L 明胶-ADSCs 微球[(4.)×106,(9.)×106,P< 0.05;(7.)×106,(15.)×106,P< 0.05],这说明加入明胶成分的微球比不加入明胶成分的微球对细胞增殖更具有积极意义。
2.6 含细胞微球内的细胞活性 Live/Dead 染色结果显示,含细胞两微球培养第0 天的ADSCs 均具有较高且较为相似的细胞活性,海藻酸盐-ADSCs 微球第7 天开始观察到部分死亡细胞(红色),且至第14 天时观察到更多的死亡细胞,见图6;与海藻酸盐-ADSCs 微球相比,海藻酸盐-5 g/L 明胶-ADSCs 微球培养14 d 内的细胞死亡不明显,见图7,这表明明胶对保持微球中ADSCs 的高活性是常有益的。
Image J 统计定量分析结果显示证实了染色结果,海藻酸盐-ADSCs 微球与海藻酸盐-5 g/L 明胶-ADSCs 微球培养第7,14 天的活细胞比率比较差异均有显著性意义[(82.)%,(93.)%,P< 0.05;(75.)%,(93.)%,P< 0.05],见图8,这说明明胶可以保持细胞活性的性质[20],在保持藻酸盐微球中ADSCs 的活性也具有重要意义。
2.7 含细胞微球内的细胞形态变化 共聚焦显微镜观察结果显示,部分细胞具有极小范围伸展的形态变化,其中含明胶成分的微球中细胞伸展的稍多,但相比较于传统平板培养,被包裹在微球中的细胞所形成的伪足极小,见图9。由于细胞被水凝胶微球包裹导致细胞伸展不明显,细胞形态将不作为细胞活性观察指标。
2.8 含细胞微球的成软骨能力 成软骨诱导培养基诱导21 d后分阿尔新蓝染色显示,海藻酸盐-ADSCs 微球内含有可被阿尔新蓝染色为蓝色的酸性糖胺聚糖成分,见图10A;海藻酸盐-5 g/L 明胶-ADSCs 微球诱导后的染色着色更深,见图10B,且两组使用相同种类、浓度的阿尔新蓝染色液,进行相同的染色时间,保证了染色方法两组间均一,证实了海藻酸盐-5 g/L 明胶-ADSCs 微球有更多的细胞外基质沉积,使着色更深。
硫酸化糖胺聚糖定量分析结果显示,随着诱导时间的增加,两种含细胞微球内的硫酸化糖胺聚糖水平增加,与染色定性实验相似,海藻酸盐-5 g/L明胶-ADSCs微球诱导培养第7,14,21 天分泌的硫酸化糖胺聚糖水平高于海藻酸盐-ADSCs 微球[第7 天:(3.),(1.) mg/L,P< 0.05;第14 天:(8.),(4.) mg/L,P< 0.05;第21 天:(19.),(10.) mg/L,P< 0.05],见图10C。此定性和定量结果表明了在成软骨分化方面,含明胶成分微球的促成软骨分化优于传统海藻酸盐微球。
3 讨论 Discussion
软骨损伤愈合较难已成为了广泛的共识[26]。组织工程技术为软骨损伤的修复提供了一些极具价值的方法[27]。组织工程技术中含有合适的种子细胞至关重要[28-30]。ADSCs 在软骨组织工程领域是一种极具潜力的细胞[31-32]。此次实验通过流式细胞术鉴定以确定成功提取ADSCs,并且通过3 系诱导分化证明了ADSCs 的多向分化能力。ADSCs 与其他间充质干细胞同样具有成软骨分化能力,更重要的优势在于ADSCs来源于脂肪组织,人体中脂肪组织丰富,相比于术中骨髓间充质干细胞的提取分离,ADSCs 更易于获得,并且具有成软骨分化能力,在软骨损伤修复领域是一种具有巨大潜力的种子细胞。
将种子细胞植入特定的软骨缺损部位也是软骨组织工程中的重要环节[27]。微球修复软骨损伤的方法已被广泛应用并取得了很好的效果[33]。与化学乳化法微球制备技术相比,电喷雾合成的微球有着高细胞装载效率[34]。化学乳化法操作复杂、步骤繁琐,细胞贴附于微球并且增殖过程仍需要大量的时间,这样将直接导致患者二次手术时间延长及社会和经济负担加重,电喷雾法避免了这一问题,可直接将种子细胞包埋于微球中;另外,电喷雾技术还可以非常有效地避免添加不可降解的活性剂,更有利于临床转化,是将细胞负载至微球的首选方法[34-37],于是实验采用电喷雾法制备生物材料。
在组织工程领域合适的微环境是重要因素之一。海藻酸盐-明胶材料可为细胞提供合适的软骨细胞生长微环境[38]。在电喷雾法制备微球中采取了4 种质量浓度的明胶与海藻酸盐配比作为相互对照,结果表明,在海藻酸钠中添加B 型明胶5 g/L 是制备完整微球的最佳质量浓度,证明了较高质量浓度的明胶无法合成完整微球或者在常温条件下凝固,无法通过电喷雾方法合成微球。实验结果显示5 g/L 明胶成分的加入与传统海藻酸盐微球直径相似,球形完整。对于明胶成分而言,高质量浓度在常温下黏性较强,无法完全溶解而通过电喷雾针头使液体分散成小液滴,无法通过简便的电喷雾法制备出完整微球,临床转化能力差。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0522/785.html