电喷雾法制备海藻酸盐明胶脂肪干细胞微球及其(2)
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【摘要】1.4.4 制备含明胶的海藻酸盐微球 根据文献报告[22],选择了质量浓度为15 g/L 的海藻酸钠溶液和20 g/L 的氯化钙溶液,以便制备出完整且规则形状的微球。为
1.4.4 制备含明胶的海藻酸盐微球 根据文献报告[22],选择了质量浓度为15 g/L 的海藻酸钠溶液和20 g/L 的氯化钙溶液,以便制备出完整且规则形状的微球。为了探索合适的明胶质量浓度,在40 ℃条件下将明胶以5,15,25 g/L 的质量浓度分别溶于15 g/L 的海藻酸钠溶液中。电喷雾装置由高压电源(0-10 kV)和定量推进注射器泵组成。使用电喷雾装置将海藻酸钠溶液和上述3 种质量浓度的海藻酸钠明胶混合溶液分别喷雾到氯化钙溶液中,将电压设置为6.5 kV,喷雾针尖距氯化钙液面3 cm,溶液前进速度为15 mL/h,制备海藻酸盐微球和海藻酸盐-明胶微球。使用光学显微镜观察微球的外观,评估明胶质量浓度对水凝胶成球的影响,然后筛选出可以制成完整微球的溶质质量浓度。
1.4.5 合成ADSCs 的微球 选取可成功制备微球的合适明胶质量浓度。对于含ADSCs 的微球,首先将107个ADSCs 分别溶解于10 mL 的15 g/L 藻酸钠溶液和10 mL 的15 g/L 藻酸钠-5 g/L 明胶溶液中。然后通过上述参数,使用电喷雾装置将溶液喷雾到氯化钙溶液中,形成海藻酸盐-ADSCs 微球和海藻酸盐-明胶-ADSCs 微球。形成10 min 后,将含有ADSCs 的微球在氯化钙溶液中收集。
然后,将收集的藻酸盐微球和海藻酸盐-明胶微球和含ADSCs 的微球通过光学显微镜观察成像。随机选择每组具有完整球体的30 个微球体(n=30),使用图像分析软件(Image J)测量其直径。
1.4.6 微球的培养 将含ADSCs 的微球在旋转细胞培养系统中培养14 d,使用的培养基是含100 U/mL 青霉素/链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM,每2 d 更换一次培养基。旋转细胞培养系统RCCS 的旋转速度设置为15 r/min,在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中连续旋转。
细胞增殖与活性:培养第0,7,14 天后,将3 mL 的微球用9 g/L 氯化钠溶液洗涤两三次,然后在55 mmol/L 柠檬酸钠溶液中液化15 min,使用锥虫蓝染色并立即计数。用血细胞计数器在显微镜放大10倍下计数细胞并计算总细胞数,每组计数取3 个不同的视野,分别由3 位不同的观察者进行重复以减少误差。
培养第0,7,14 天后,通过live-dead 细胞存活力测定法确定两种微球中ADSCs 的存活率。首先将微球用PBS 洗涤,然后浸入6 孔板中的1 mL 活/死染色溶液中。为了确保染料扩散到整个溶液中,将样品在Live/Dead 染色溶液中于黑暗处孵育15 min,荧光显微镜下观察。每个样本各取3 个视野,将所得到的观察结果通过Image J软件进行计数定量分析,计算活细胞(绿色)与总细胞的比例以便算出存活率。
细胞的形态变化观察:培养第0,7 天后,将两种微球于黑暗条件下使用上述的Live/Dead 染色液中孵育15 min,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光细胞的形态。
成软骨能力:使用成软骨分化培养基诱导上述两组微球,每2 d 更换一次培养基。诱导21 d 后进行阿尔新蓝染色30 min,光学显微镜下观察。
成软骨诱导培养第0,7,14,21 天后,用55 mmol/L檬酸钠溶液消化过夜。次日用 1,9-二甲基亚甲蓝染料法通过吸光度值对应拟合标准曲线,计算样本的糖胺聚糖含量,再算出每毫升样品中的硫酸化糖胺聚糖含量。
1.5 主要观察指标 两种微球内细胞的增殖能力、活性与成软骨能力。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计软件进行分析。数据以表示,组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,检验水准P=0.05。
2 结果 Results
2.1 ADSCs流式细胞术检测结果 流式细胞仪分析结果显示,分离的ADSCs 间充质干细胞标志CD29 呈阳性(98.93%),而造血谱系标志物CD45 和内皮细胞标志物CD31 的表达水平极低(0.48%,0.48%),见图1。可以推断分离的细胞确为ADSCs[23],CD34 的表达水平也与其他文献一致[24]。
2.2 ADSCs 的表征及分化能力 光学显微镜下可见,P3 代ADSCs 具有扁平的成纤维细胞样形态,这与其他文献报道相一致[25]。在培养瓶中生长的ADSCs 显示了其具有分裂增殖的能力,见图2A;在成脂肪诱导培养基中培养ADSCs 21 d 后,油红O 染色观察到细胞内脂质滴,见图2B,发现其具有成脂肪分化能力;将ADSCs 在软骨诱导培养基中培养21 d 后,阿尔新蓝染色可见蛋白聚糖基质的软骨组织,见图2C;在成骨诱导培养基中培养ADSCs 21 d 后,茜素红S 染色观察到的细胞中含有钙沉积,见图2D,证实了其成骨分化能力。
2.3 电喷雾微球的形态学特征 通过电喷雾制备了海藻酸盐微球与含不同质量浓度明胶的海藻酸盐-明胶微球,其中海藻酸盐-25 g/L 明胶基团在室温下固化导致电喷雾化管堵塞,无法制备微球;海藻酸盐微球和海藻酸盐-5 g/L 明胶微球的外观相似且形状完整,见图3A,B,微球直径分别为(365.),(358.) μm,二者比较差异无显著性意义(P>0.05);海藻酸盐-15 g/L 明胶微球圆度下降、微球破裂,无法成球,见图3C。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0522/785.html