载血小板衍生生长因子生物打印半月板支架的制(3)
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【关键词】
【摘要】CCK-8 法检测细胞增殖:通过CCK-8 法检测单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架浸提液培养的滑膜间充质干细胞增殖情况。将3 种支架置于无
CCK-8 法检测细胞增殖:通过CCK-8 法检测单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架浸提液培养的滑膜间充质干细胞增殖情况。将3 种支架置于无菌DMEM/F12 培养基中,于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱内放置24 h,吸取浸提液备用。将第4 代滑膜间充质干细胞按2 000 个/孔接种于96 孔板中,每孔100 μL,细胞黏附2 h 后弃去含有体积分数1%胎牛血清的原培养基,分4 组培养,分别加入DMEM/F12 培养基(阴性对照)、PCL支架浸提液、PCL/GelMA/MECM 支架浸提液、PCL/GelMA/MECM/PDGF 支架浸提液,浸提液体积均为100 μL。培养1,4,7 d 后,弃去原培养基后PBS 清洗一遍,每孔加入110 μL的含有10 μL CCK-8 溶液的DMEM/F12 培养基,37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。孵化完成后在450 nm 波长处检测吸光值。每组样品重复5 次,结果取平均值。
1.4.5 3D 打印支架的生物相容性 取第3 代滑膜间充质干细胞,消化计数分别种植于PCL 支架(对照组)、PCL/GelMA/MECM 支 架 和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支 架 上(2.5×105/支架),置于37 ℃培养箱中孵育2 h 以待细胞贴壁,随后添加DMEM/F12 培养液孵育。
细胞活性观察:培养4 d 后进行死活染色。将5 μL 钙黄绿素-AM 及20 μL 乙锭二聚体-1 加到10 mL 无菌PBS 中,取适量加入各孔中室温下30 min,继续用无菌PBS 轻柔清洗3 次后吸净PBS,激光共聚焦显微镜下拍照观察。
细胞黏附及生长观察:培养1,4,7 d 后,扫描电镜观察细胞黏附形态和生长状况。PBS 清洗2 次后加入4%戊二醛溶液固定支架2 h,弃去固定液后继续PBS 清洗2 次,分别用体积分数50%,70%,80%,90%,100%的乙醇梯度脱水,每次脱水10 min,将样本轻粘于导电胶上,真空干燥后喷金,扫描电镜观察并拍照。
1.5 主要观察指标 3D 生物打印PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB半月板支架的理化性能及对滑膜间充质干细胞增殖与迁移的影响。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计软件分析实验数据。数据以表示,均进行方差统计分析,多组间采用单因素ANOVA 分析,组间采用独立样本t检验,P< 0.05 为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 3D 生物打印支架的大体观 所有支架均成功打印,大体观可见两种支架呈半圆环状结构,PCL 支架呈白色的十字交叉网格结构,纤维排列均匀整齐,支架内部孔隙互通性较好;3D 生物打印支架可见PCL 纤维之间有生物墨水材料填充,分布较为均匀,见图1。
2.2 3D 打印支架的扫描电镜观察 扫描电镜下观察发现,PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架均呈三维交叉网格状结构,PCL 支架纤维直径规则,间隙均匀连通性好;PCL/GelMA/MECM 支架可见凝胶均匀填充于PCL 纤维之间,冷冻干燥处理后表面较为疏松多孔,见图2。
2.3 3D 打印支架的力学性能 单纯PCL 支架的压缩模量为(11.) MPa,3D 生 物 打 印PCL/GelMA/MECM 支 架 为(12.) MPa,两者之间比较差异无显著性意义(P>0.05);单纯PCL 支架的拉伸模量为(32.) MPa,3D 生物打印PCL/GelMA/MECM 支架为(32.) MPa,两者之间比较差异无显著性意义(P> 0.05),说明复合生物墨水打印并未明显影响到支架的力学性能,见图3。
2.4 3D 打印支架的缓释特性 负载于GelMA-MECM 生物墨水中的PDGF-BB 在缓释检测的28 d 内,前3 d 的短期释放情况表现为突释现象,释放较快,因子累计释放率达30.51%,随后的释放速度逐渐减缓,3-28 d 的释放规律类似于零级释放动力学,可以持续缓释因子达28 d,累计释放率达80.42%,并且28 d 后仍有缓慢释放的趋势,见图4。
2.5 不同支架对滑膜间充质干细胞迁移的作用 各组细胞迁移及统计分析结果见图5 所示,PCL 支架组和阴性对照组细胞迁移数最少,且两者比较差异无显著性意义(P> 0.05);与阴性对照组相比,PCL/GelMA/MECM 支架组、PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架组细胞迁移数明显增多(P< 0.001,P< 0.000 1);PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架组细胞迁移数多于PCL/Gel-MA/MECM 支架组(P< 0.000 1)。
2.6 不同支架对滑膜间充质干细胞增殖的影响 支架浸提液培养细胞1,4,7 d 后细胞数量明显增多,见图6。
PCL 支架组与阴性对照组不同时间点的吸光度值比较差异无显著性意义(P> 0.05),说明PCL 材料无细胞毒性;PCL/GelMA/MECM 支架组培养4,7 d 的吸光度值高于阴性对照组(P< 0.05),提示其有促进滑膜间充质干细胞增殖的作用;PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架组培养4,7 d 的吸光度值高于阴性对照组(P< 0.0001),说明其有促进滑膜间充质干细胞增殖的作用。因此,适当浓度的PDGF-BB 具有促进滑膜间充质干细胞增殖的作用,生物打印半月板支架可以通过缓释PDGF-BB 提升干细胞的增殖性能。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0517/769.html
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