载血小板衍生生长因子生物打印半月板支架的制(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】1.4 实验方法 1.4.1 生物墨水的制备 依据苑志国等[19-20]方法制备猪的脱细胞MECM。将新鲜的成年猪半月板(购自北京市岳各庄菜市场)取出,去除多余滑膜组织
1.4 实验方法
1.4.1 生物墨水的制备 依据苑志国等[19-20]方法制备猪的脱细胞MECM。将新鲜的成年猪半月板(购自北京市岳各庄菜市场)取出,去除多余滑膜组织并切割成为约1 mm×1 mm×1 mm的薄片,将组织碎块装入无菌容器中,使用医用双氧水(体积分数为3%)和无菌PBS 分别漂洗3 次,每次5 min;最后一次漂洗后选取部分组织进行细菌培养,确认无菌后将组织碎块加入去离子水中,用匀浆机破碎成悬浮浆料,悬浮浆料的质量浓度为10 g/L。将浆料置于RC-6+型低温高速离心机中,4 ℃下1 500 r/min 离心5 min,分离大颗粒的悬浮微粒;之后取上清液,4 ℃下2 000 r/min 离心15 min;再次取上清液,4 ℃下6 000 r/min 离心20 min;最后取上清液,4 ℃下10 000 r/min离心30 min,收集沉淀。然后混匀沉淀与无菌PBS,4 ℃下10 000 r/min 离心30 min,重复3 次。最终制成质量浓度为30 g/L 的混悬液。
取一定质量GelMA 溶于PBS 中配成质量浓度为200 g/L 的GelMA 溶液。取一定体积MECM 混悬液和等体积的GelMA 溶液混合,加入一定体积的0.25%LAP 溶液,最终制备成GelMA/MECM 生物墨水。将GelMA-MECM 生物墨水与100 mg/L 的PDGF-BB 溶液以9 ∶1 体积混合制备包含生长因子的功能化生物墨水,其中PDGF-BB 的工作质量浓度为10 mg/L,此特定质量浓度参考前期研究报道[21]。
1.4.2 3D 生物打印半月板支架的制备 结合家兔半月板的体外组织学和生物力学多角度综合分析不同层次参数,经计算机辅助设计构建半月板三维设计CAD 数字模型,支架储存为STL 格式,输入3D 生物打印机设备中,设定支架层-层之间的排列角度和孔径大小,分别打印单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB支架。打印程序如下:3D 生物打印机胶喷头1 内径400 μm,料筒1 温度设置为85 ℃,以5 mm/s 速度打印PCL;喷头2 内径 500 μm,料筒2 温度为20 ℃,以5 mm/s 打印生物墨水,蓝关交联时间为20 s,生物墨水材料打印后溶胀至800-900 μm。半月板组织工程支架打印参数设定为:内径5.5 mm,外径11 mm,高度1 mm。
1.4.3 3D 打印支架的理化性质表征
支架形态及微观结构观察:取单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架,大体观察其形态,经过冷冻干燥以及真空喷金处理后,扫描电镜下观察其微观形态并采集相片。
支架力学性能检测:利用CMT5304-30KN 型微机控制电子万能试验机和EZ-LX 型单柱式电子万能试验机对单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架的压缩和拉伸性能分别进行测试,每组均重复4 个样品。①压缩模量测试:将两种支架制备为5 mm×5 mm×2 mm 的样本,PBS 浸润后进行测试。预压缩5%,压缩速率为4.5 mm/min,压缩20 个循环后进行正式测试,最大压缩10%,测试得出应力-应变曲线,计算其压缩模量。②拉伸模量测试:将两种支架制备为24 mm×5 mm×2 mm 的样本,PBS 浸润后进行测试。预拉伸 5%,拉伸20 个循环后进行正式测试,以12 mm/min 的拉伸速率进行拉伸,直至样品拉断,获得应力-应变曲线,计算拉伸模量。
缓释性能特性:角膜环钻钻取直径约7 mm 的PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架,设置3 个平行量,置于5 mL冻存管中,加入0.5 mL 含有0.1%牛血清白蛋白的PBS 溶液,置于37 ℃恒温摇床上60 r/min 振荡,分别于第1,2,3,5,7,14,21,28 天收集上清液,ELISA 试剂盒检测上清液中缓释PDGF-BB 量,计算支架包含的因子累计释放比例并与对应时间拟合为时-量效曲线。
1.4.4 3D 打印支架的生物学作用
滑膜间充质干细胞的分离培养:取新西兰大白兔4 只,按照文献[22-24]方法进行滑膜间充质干细胞分离、传代和培养。在无菌条件下取兔膝关节滑膜置于含有双抗的PBS 中,充分剪碎滑膜组织后加入10 倍体积的0.2%Ⅰ型胶原酶,置于37 ℃恒温箱中磁力搅拌消化1 h;然后加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液终止消化,经滤器(100 目)过滤后置于50 mL 离心管中密封15 000 r/min 离心5 min,弃去上清,加入DMEM/F12 培养液重悬细胞,移入25 cm2培养瓶,每两三天更换培养液。显微镜下观察,待细胞生长至80%-90%融合时进行传代,用0.25%的胰酶消化传代,培养至P3 代细胞备用。使用流式细胞仪进行表面特异性抗原鉴定[23]。
Transwell 小室检测细胞迁移:利用Transwell 小室检测单纯PCL 支架、PCL/GelMA/MECM 支架和PCL/GelMA/MECM/PDGF-BB 支架对于滑膜间充质干细胞迁移能力的作用。在24孔板中插入Transwell 小室,将不同支架加入下室中,吸取DMEM/F12 培养基加入载有支架的孔内,放入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内孵育2 h。之后于上室中加入细胞(2×104个/室),继续放入到37 ℃恒温箱中孵育24 h。用棉签擦除仍存在于上室中未迁移进下室的细胞,PBS 洗涤后用40 g/L多聚甲醛固定迁移至下室的细胞,固定30 min后用0.1%结晶紫进行细胞染色20 min。统计迁移的滑膜间充质干细胞数目,以每孔6 个视野(×200)中的细胞平均数为迁移数据,利用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics,Bethesda,MD)来定量迁移细胞。每组样品分别重复3 次,数量迁移结果取平均值。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0517/769.html
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