构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表(2)
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【关键词】
【摘要】1.4.2 流式细胞术检测BMSCs 表面标志物 收集传代至第2代的BMSCs,用PBS 重悬细胞并计数,分装至EP 管,分别加入抗体(CD90、CD44、CD34、 CD45),混匀,室温孵育
1.4.2 流式细胞术检测BMSCs 表面标志物 收集传代至第2代的BMSCs,用PBS 重悬细胞并计数,分装至EP 管,分别加入抗体(CD90、CD44、CD34、 CD45),混匀,室温孵育30-60 min,1 500 r/min 离心10 min,去上清,PBS 洗涤2次。1 500 r/min 离心10 min,去上清,PBS 洗涤2 次。加入200 μL 的PBS 混匀细胞,上机检测。
1.4.3 BMSCs 多向分化能力鉴定
成骨诱导:按照protocol 配制兔BMSCs 成骨诱导分化培养基。收集 P2 代BMSCs,完全培养基重悬细胞并计数;按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植在预先用0.1%明胶覆盖的6 孔板中;放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,当细胞融合达60%-70%时弃完全培养基,诱导组加入2 mL 成骨诱导培养基,未诱导继续使用完全培养基培养。以后每3 d 更换一次培养基,视诱导组细胞形态及生长情况进行茜素红染色。
成脂诱导:按照protocol 配制BMSCs 成脂诱导分化培养基,分为A 液和B 液。收集 P2 代BMSCs,完全培养基重悬细胞并计数;按照2×104/cm2的细胞密度均匀种植于6 孔板中;放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,当细胞融合达100%时,诱导组弃完全培养基,加入2 mL A 液诱导3 d,吸走A 液换成B 液,24 h 后吸走B 液,换A 液;A 液和B 液交换作用3-5 次后继续用B 液维持培养4-7 d,每3 d更换一次培养基。未诱导组继续使用完全培养基培养。至实验组脂滴变得足够大、圆,进行油红O 染色观察。
1.4.4 制备干细胞膜片及鉴定
制备干细胞膜片:将P2 代BMSCs 按照9×104/cm2密度种入6 孔板中,待细胞密度达100%时去掉原培养基,干细胞膜片组加入等量的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗、50 mg/L 抗坏血酸),对照组用不含抗坏血酸的培养基(含体积分数10%胎牛血清、a-MEM 培养基、1%三抗),每3 d 更换一次培养基,干预14 d。每天光镜下观察细胞形态变化。
苏木精-伊红染色:干预14 d,干细胞膜片经固定、制备成石蜡切片,进行苏木精-伊红染色:脱蜡、苏木精染核、盐酸分化、脱水Ⅰ、伊红复染、脱水Ⅱ、透明、封固。
多向分化能力鉴定:将干预14 d 的干细胞膜片进行成骨、成脂诱导分化,对照组使用兔BMSCs 完全培养基培养,分别进行西素红染色、油红O 染色。
细胞外基质相关因子mRNA 表达:①总RNA 提取:获得干预14 d 干细胞膜片组、对照组标本,PBS 漂洗2 次,加入1 mL Trizol,静置5 min,移入1.5 mL EP 管,静置5 min;加入200 μL 氯仿,静置10 min,4 ℃12 000 ×g离心15 min;取上清,加入500 μL 异丙醇,静置10 min,4 ℃12 000×g离心15 min;弃上清,加入1 mL 体积分数75%乙醇,轻轻洗涤沉淀,4 ℃7 500 ×g离心5 min;弃上清,晾干,加入20 μL DEPC水溶解RNA,部分用于总RNA 定量,其余RNA 溶液于-80 ℃保存备用。②配制反转录反应体系(20 μL 体系),5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL,总RNA 1 000 ng,RNase Free dH2O Up to 20 μL,在冰上进行。③反转录反应条件:按照试剂盒的说明进行反转录反应。37 ℃15 min(反转录反应)→85 ℃5 s(反转录酶的失活反应)→4 ℃。上机结束后将所得c-DNA 分装,-20 ℃保存备用。④RT-PCR 反应:反转录获得的cDNA,利用RT-PCR 检测Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA表达。引物序列由TaKaRa公司协助设计合成,引物序列(5’→3’)。GAPDH F:TGA CGA CAT CAA GAA GGT GGT G,GAPDH R:GAA GGT GGA GGA GTG GGT GTC;Ⅰ型胶原F:TTC TAT TGG TCC CGT CGG T,Ⅰ型胶原R:GCT GAG TCT CAG GTC GCG;纤维连接蛋白F:ACC ATA CCT GCC GAA TGT AGA TGA,纤维连接蛋白R:CAA CCT CCT CCC GCA CTT TGT GCC。配制25 μL RT-PCR 反应体系(SYBR@ Premix Ex Taq II 12.5 μL,引物1 μL,cDNA 2 μL,RNase Free dH2O 9.5 μL)。RT-PCR 反应条件:Step1(预变性),95 ℃30 s;Step2(PCR 反应),95 ℃5 s,60 ℃30 s(40 次循环);Step3(Melt Curve),95 ℃10 s,65-95 ℃,每5 s 增加0.5 ℃。⑤数据分析:实验组、对照组样本测定3 个基因测定值,得到3 个Ct 值,GAPDH 管家基因,利用GAPDH 对目的样本基因拷贝数进行校正,以排除原始样本量差异对实验结果的影响。计算出Ct 值的平均值,根据以下公式进行计算:?Ct=Ct目的基因-Ct 内参基因,??Ct=?Ct 实验样本-?Ct 对照样本,实验组目的基因相对表达量=2-??Ct。
1.4.5 构建预血管化细胞膜片 用UVECs 培养基培养兔UVECs,每3 d 更换一次培养基,传至P2 代进行干预,每天镜下观察细胞形态变化。获取干预14 d 的干细胞膜片,弃抗坏血酸培养基,PBS 洗涤。实验组在干细胞膜片上加入P2代UVECs 共培养,种植密度为5×104/cm2,用兔UVECs 培养基进行培养;对照组为P2 代UVECs 单独培养,种植密度为5×104/cm2,用兔UVECs 培养基进行培养。每2 d 更换一次培养基,干预14 d,每天镜下观察细胞形态及大体改变。
文章来源:《材料保护》 网址: http://www.clbhzzs.cn/qikandaodu/2021/0305/502.html
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